Das Designermolekül "swiss-army-knife" erfasst RNA in einzelnen Zellen in ihrer natürlichen Gewebeumgebung

Das Designermolekül "swiss-army-knife" erfasst RNA in einzelnen Zellen in ihrer natürlichen Gewebeumgebung

Video: Folge 259 – Turbulenz • Welt der Physik • Podcast • (Kann 2020).

Anonim

von der University of Pennsylvania School of Medicine

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Ein multidisziplinäres Team der University of Pennsylvania hat in Nature Methods eine einzigartige Methode veröffentlicht, um RNA aus lebenden Zellen in ihrer natürlichen Gewebemikroumgebung zu isolieren, ohne benachbarte Zellen zu beschädigen. Auf diese Weise können die Forscher analysieren, wie chemische Verbindungen von Zelle zu Zelle die Funktion der einzelnen Zellen und die gesamte Proteinproduktion beeinflussen.

Natürlich sind Gewebe komplexe Strukturen, die sich aus verschiedenen Zelltypen zusammensetzen. Die Identität und Funktion der einzelnen Zellen in jedem Gewebetyp - Herz, Haut, Gehirn zum Beispiel - sind eng miteinander verknüpft, wodurch Gene in RNA und letztendlich Proteine ​​transkribiert werden. Um die Genexpression in einzelnen Zellen in ihrem natürlichen Gewebe zu untersuchen, müssen Forscher in der Lage sein, das Innenleben einer Zelle zu untersuchen, so wie es ein Ökologe tut, wenn er untersucht, wie eine einzelne Spezies mit ihrem Lebensraum interagiert.

Sogar Zellen des scheinbar gleichen Typs sind auf molekularer Ebene nicht identisch. Das meiste Wissen über die Variabilität der Genexpression wurde aus Studien mit heterogenen Zellgruppen gewonnen, die in Kultur gezüchtet wurden. Forscher bezweifeln die Fähigkeit, "echte Biologie" aus diesen unnatürlichen Bedingungen zu extrapolieren. Tools zur Untersuchung, welche Art und wie viel RNA in einzelnen Zellen in intaktem Gewebe vorhanden ist, bieten eine einzigartige Gelegenheit, um zu beurteilen, wie Säugetierzellen tatsächlich funktionieren und wie diese Funktion bei verschiedenen Krankheiten und eventuell beim Testen neuer Medikamente gestört werden kann.

James Eberwine, Professor für Pharmakologie an der Perelman School of Medicine und Co-Direktor des Penn Genome Frontiers Institute (PGFI), und Ivan Dmochowski, Dozent für Chemie an der School of Arts and Sciences, Co-Regisseur dieser Studie. Weitere Autoren von Penn sind Jai-Yoon Sul, Ph.D., Assistenzprofessor für Pharmakologie, M. Sean Grady, MD, Lehrstuhl für Neurochirurgie, beide von der Perelman School of Medicine, sowie Junhyong Kim, Ph.D., Professor für Biologie und Co-Direktor des PGFI.

"Unsere Daten zeigten, dass die Gewebemikroumgebung die RNA-Landschaft einzelner Zellen prägt", sagt Eberwine. Die neue Technik heißt TIVA, kurz für Transkriptom-In-vivo-Analyse.

Das Team verwendete diese nicht-invasive Methode, um die RNA einer einzelnen Zelle in lebendem Gewebe von Mäusen und menschlichen Zellen und insbesondere menschliches Gewebe, das innerhalb von Minuten nach Abschluss der Neurochirurgie aus Gehirnoperationen gewonnen wurde, physikalisch zu isolieren.

Cleveres Design

Das TIVA-Tag ist ein Molekül vom Typ Schweizer Taschenmesser, das die zahlreichen chemischen Hilfsmittel enthält, die zur Erfassung der mRNA aus einer Zelle benötigt werden, ohne dass Nachbarn davon betroffen sind.

Das erste Werkzeug ist eine Sequenz von Aminosäuren, die es den Molekülen ermöglicht, die Wände einer Zelle zu infiltrieren, ohne sie oder das umgebende Gewebe zu beschädigen. Anstatt zu diesem Zeitpunkt auf eine bestimmte Zelle abzuzielen, wuschen die Forscher die gesamte Gewebeprobe mit einer Lösung aus dem Gehirn, die TIVA-Tags enthielt, und führten das Molekül in alle Zellen ein.

Da dieses Verfahren bedeutet, dass das Molekül nicht nur in einer Zelle von Interesse, sondern in allen Nervenzellen des Gehirns vorhanden ist, müssen die Forscher die mRNA-Erfassungsfunktion des TIVA-Tags so lange ausschalten, bis der richtige Zeitpunkt erreicht ist. Dies wird durch das zweite Werkzeug des Tags erreicht, einen entfernbaren "Käfig", der die Bindungsstelle des Moleküls abdeckt.

Das TIVA-Tag baut auf früheren Arbeiten des Eberwine-Labors auf, bei denen DNAs und eine Einfangsequenz zur Isolierung von RNA-bindenden Proteinen aus lebenden Zellen photoaktiviert wurden, sowie auf Arbeiten des Dmochowski-Labors, das an verschiedenen Iterationen von lichtaktivierten Oligonukleotiden gearbeitet hat seit über einem Jahrzehnt. "Diese Moleküle werden in dem Sinne 'eingesperrt', dass wir ihre Funktion physisch blockieren, bis wir ihnen den Schlüssel geben, nämlich Laserlicht", sagt Dmochowski. "Sobald der Käfig ausgeschaltet ist, können sie tun, was sie wollen: sich an mRNA binden."

Ihre Bindungsfähigkeit beruht auf der sich lange wiederholenden Kette von Uracil, einer der vier Basen der RNA. Diese "Poly-U" -Sequenz soll an eine entsprechende "Poly-A" -Sequenz binden, eine sich wiederholende Kette von Adeninbasen, die sich auf allen mRNA-Molekülen befindet. Um diese Fähigkeit vorübergehend zu blockieren, gaben die Forscher dem TIVA-Tag einen Käfig aus einem Paar von Poly-A-Sequenzen.

"Auf diese Weise ist es sehr glücklich und stabil für sich selbst", sagt Dmochowski. "Diese Poly-A-Sequenzen sind jedoch durch zwei Linker an das Molekül gebunden, die mit einem Laser aufgebrochen werden können. Durch das Eintreffen von blauem Licht, das genug Energie hat, um diese Bindungen aufzubrechen, zerfällt das Molekül so, dass das Poly -U-Sequenz wird aufgedeckt und kann mit der Bindung an mRNA beginnen.

Die Präzision des blau aktivierenden Lasers ist so, dass die Forscher die Käfige von TIVA-Tags in einer einzigen Zelle aufbrechen können. Um jedoch sicherzustellen, dass diese Tags in die Zielzelle gelangt sind, prüfen sie diese zuerst mit einem weniger leistungsstarken grünen Laser. Dieser Laser interagiert mit einem anderen Werkzeug des Tags: einem Paar fluoreszierender Farbstoffe.

Diese Farbstoffe sind genau positioniert: einer befindet sich in der Nähe der Poly-U-Sequenz und der andere in der Nähe der Poly-A-Sequenz. Wenn der Käfig des Moleküls noch verriegelt ist, sind sie nahe genug beieinander, dass sie untereinander Energie vom Laser übertragen können. Laut Sul von Pharmacology ist die Untersuchung einer Zelle mit einem grünen Laser und die Erzeugung einer Lichtemission, die diesem Energietransfer zwischen den Farbstoffen entspricht, ein Signal dafür, dass das Tag es in die Zelle geschafft hat.

Nachdem die Tags mit dem stärkeren blauen Laser aktiviert wurden, können die Forscher die Zelle erneut mit dem grünen Laser untersuchen. Das Fehlen des Signals bedeutet, dass die Farbstoffe getrennt werden und der Käfig entfernt wurde.

Das letzte Werkzeug der Zelle ist ein Biotin-Marker, der am Ende des Moleküls mit der Poly-U-Sequenz angebracht ist. Nachdem die Forscher die Tags aktiviert haben, brechen sie die Zielzelle auf, um sie mit der eingefangenen mRNA im Schlepptau freizusetzen. Die Forscher verwenden eine Perle mit einem Bakterienprotein, das eine hohe Affinität für Biotin aufweist.

Zellprofiler

Das Tag interagiert chemisch mit der mRNA in der Zelle über Wasserstoffbrücken und kann als Griff verwendet werden, um das gesamte mRNA-Komplement dieser Zelle zu isolieren. Da die Tag-Aktivierung mit Licht erreicht wird, kann jede Zelle im lebenden Gewebe gezielt angegriffen werden. Diese Perle sammelt die Tags, an welchem ​​Punkt die angehängte mRNA gereinigt, amplifiziert und sequenziert werden kann.

Das Team analysierte dann die Genexpression in einzelnen Neuronen und verglich sie mit anderen Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Zum Beispiel stellten Kim und das Team von Biology beim Vergleich der Häufigkeit von mRNA in Zellen in intaktem Hirngewebe mit der in einer Mischung von Nervenzellen in Kultur überrascht fest, dass suspendierte Zellen im Vergleich zu Zellen in intaktem Gewebe mehr Gene exprimierten. als ob die isolierten Zellen mehr RNA produzieren würden, um für alles bereit zu sein, ohne dass von den umgebenden Zellen irgendwelche aussagekräftigen chemischen Signale empfangen würden.

In Zusammenarbeit mit Neurosurgery's Grady konnte das Team den TIVA-Ansatz verwenden, um das RNA-Komplement einzelner menschlicher kortikaler Neuronen aus Präparaten in Lebendschnitten zu isolieren und zu charakterisieren, bei denen die Neuronenverbindungen intakt bleiben.

Der TIVA-Ansatz verspricht, wichtige Aspekte der menschlichen Neurobiologie und Krankheit herauszustellen, ohne zuvor menschliche Neuronen zu isolieren. So wurden solche Experimente bisher durchgeführt. Das Team entwickelt derzeit zusätzliche TIVA-Tags mit unterschiedlichen Funktionsgruppen, so dass mehrere Tags in dieselbe Zelle oder in mehrere Zellen eingefügt werden können und die Dynamik, wie verschiedene Moleküle in einzelnen Zellen funktionieren, quantifiziert und in ihrem natürlichen Gewebe verglichen werden kann.