Die Forscher teilen das Enzym, um das genetische Rätsel zu lösen

Die Forscher teilen das Enzym, um das genetische Rätsel zu lösen
Anonim

von der Rice University

Forscher der Rice University haben einen Weg gefunden, Enzyme zu teilen und zu modifizieren, um das zu schaffen, was einem genetischen Logikgatter gleichkommt.

Der Biochemiker Matthew Bennett und sein Doktorand David Shis erstellten eine Bibliothek von AND-Gattern, indem sie ein Protein aus einem bakteriellen Virus mutierten. Das als T7-RNA-Polymerase (RNAP) bekannte Protein ist ein starker Transkriptionstreiber in Zellen.

Ihre Entdeckung soll helfen, einen Engpass bei der Entwicklung synthetischer Gennetzwerke zu überwinden, die digitale Schaltkreise imitieren. Diese Netzwerke könnten zu Diagnosesystemen werden, die nach Anzeichen von Krankheiten und möglicherweise nach Gentherapien suchen, um Krankheiten in einem Schritt zu finden und zu behandeln.

Die Forschung erschien diese Woche online in den Proceedings der National Academy of Sciences .

"UND-Verknüpfungen sind normalerweise in der Elektronik zu finden: Sie haben einen Schaltkreis mit zwei Eingängen und einem Ausgang", sagte Bennett, Assistenzprofessor für Biochemie und Zellbiologie. "Wenn in einem UND-Gatter die beiden Drähte, die zum Gatter führen, eingeschaltet sind, ist auch der Ausgang eingeschaltet. Wenn einer oder beide ausgeschaltet sind, ist der Ausgang ausgeschaltet."

Forschern, die zuverlässige und flexible Komponenten für ihre Syntheseschaltungen suchen, standen nur wenige Optionen zur Verfügung. Die bei Rice erstellte Bibliothek von UND-Gattern sollte die verfügbare Toolbox zum Aufbau größerer und komplexerer Gen-Schaltkreise erheblich erweitern, sagte Bennett.

In seinem nativen Zustand in voller Länge aktiviert T7 RNAP Gene, die einen spezifischen "Promotor" oder eine spezifische DNA-Zielsequenz aufweisen. Die Reisforscher fanden heraus, dass sie DNA zur Expression des RNAP in zwei Teilen programmieren konnten, die über Punktmutationen manipuliert werden konnten, um auf verschiedene Promotoren in einer Wirtszelle abzuzielen. "Die beiden Teile des RNAP könnten sogar in verschiedenen Teilen der Zelle hergestellt werden und sie werden sich immer noch finden", sagte Bennett. "Sie haben eine Affinität zueinander, und wenn sie sich verbinden, werden sie zusammenarbeiten, als wären sie nicht gespalten worden."

Das Enzym übte seine Funktion nur aus, wenn beide Hälften des gespaltenen RNAP vorhanden waren. Bennett und Shis modifizierten das Bakterium E. coli, um die RNAP-Segmente als Reaktion auf bestimmte Zuckermoleküle in der Umwelt zu produzieren. Eine Hälfte des RNAP wird nur in Gegenwart von Arabinose und die andere in Gegenwart von Laktose hergestellt. Wenn beide Zucker gefunden würden, würde ihre Proof-of-Concept-Polymerase ein Zielgen aktivieren, in diesem Fall ein Reportergen, das für ein grün fluoreszierendes Protein kodiert.

Besser noch, der RNAP war orthogonal; das heißt, es hat sich nicht mit den nativen Proteinwegen von E. coli verbrüdert. "Mit diesem speziellen T7-RNAP wird kein anderes Gen als sein spezifisches Ziel aktiviert", sagte Bennett. "Auf diese Weise ist es für den Host transparent. Auf diese Weise können wir auf einfache Weise feststellen, ob es funktioniert oder nicht."

Die Forscher stellten fest, dass gespaltenes T7-RNAP bei der Expression von Proteinprodukten nicht so aktiv war wie die Polymerase in voller Länge, die Stücke jedoch stabiler und weniger anfällig für Mutationen waren, die die Funktion eines Genschaltkreises beeinträchtigen könnten.

Bennett sagte, dass der nächste Schritt darin bestehen würde, den gespaltenen RNAP in anderen Wirten als E. coli zu testen. "Wir wollen dies auf kompliziertere Organismen übertragen: Eukaryonten wie Hefen, Zebrafische oder Säugetierzellen. Es wird ein wenig Technik erfordern, um sie in komplizierteren Organismen zum Einsatz zu bringen."

Er sieht in der fortgeschrittenen Diagnostik ein vernünftiges Ziel für Gen-Schaltkreise, die UND-Gatter verwenden. "Die beiden Eingänge können so programmiert werden, dass sie auf unterschiedliche Bedingungen reagieren, unabhängig davon, ob es sich um Umgebungsfaktoren außerhalb des Organismus oder um gewebespezifische Marker in einem mehrzelligen Organismus handelt", sagte Bennett.

"Zum Beispiel könnten Ihre Eingaben Krebsmarker sein, die ein fluoreszierendes Reportergen zur Diagnose oder Tumorsuppressoren zur Behandlung auslösen", sagte er. Darüber hinaus können mehrere Gatter aus der Bibliothek kombiniert und geschichtet werden, um kompliziertere Schaltungen zu erstellen, die gleichzeitig viele Variablen überwachen. "Dies bedeutet, dass Sie Schaltkreise aufbauen können, die nur unter ganz bestimmten Bedingungen eingeschaltet werden. Dies ist wichtig, wenn Sie Tumorzellen abtöten möchten, ohne gesundes Gewebe zu schädigen."